甘氨酸和谷氨酸的作用 谷氨酸和甘氨酸在N-甲基d-天冬氨酸受体结合域的异构化的推动作用

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甲基-d-天冬氨酸酯受体（NMDAR）是必需的异构阳离子通道用于大脑中的神经元突触可塑性机制，它们充当突触前的重合检测器和突触后活动，导致突触强化。

由于NMDAR发挥的核心作用在谷氨酸能神经元传递中，它们的失调是相关的，许多离子型谷氨酸受体（iGluRs已被显示形成同异体离子通道，而NMDAR已知仅形成异构通道。

大鼠cDNA是构建编码GluN1的细胞外LBD的过程，该cDNA包含S1区域（Met394-赖氨酸544），与其S2区域（Arg663-爵士800）通过Gly-Thr链接器相连接，同样地，GluN2A的LBD也是连接其S1区域（亲401-精氨酸539）到S2区域通过Gly-Thr链接器进行构建的。

每个LBD在果蝇S2细胞中作为分泌蛋白使用载体表达，其中包含果蝇BiP分泌信号和C型末端（His8）标记用于检测和亲和色谱纯化。

蛋白质经过三步纯化过程，包括磷酸纤维素树脂交换色谱、Ni-NTA亲和纯化和AktaSuperdex200体积排阻色谱，所有纯化步骤在30mMHepes/75mM氯化钠缓冲液（pH7.6）中进行。

沉降速度和沉降平衡分析是在OptimaXL-I分析超速离心机上进行的，沉降速度研究在蛋白质浓度为0.2-0.8mg/mL（无论是否存在配体）下以35,000rpm的速度完成，沉降平衡数据则在三个不同的转子速度（即17,000、21,000和23,000rpm）和相同的蛋白质浓度范围（0.2-0.8mg/mL）下进行。

检测方法使用的是A280纳米波长，样品在进行速度分析时使用双扇区中心和六扇区中心，在20°C温度下进行平衡分析的核心部件，用的缓冲液是30mMHepes/75mMNaCl，pH7.6，含有或不含有400-500μM的l-谷氨酸或甘氨酸/d-血清平衡。

每6小时收集一次扫描，直到最后两次扫描完全重叠，蛋白质的部分特定体积以及溶剂的粘度和密度通过Sednterp计算，蛋白质的部分比体积根据各自的序列计算，通过SEDFIT分析速度数据，并绘制连续沉降的地图系数分布c(s)或摩尔质量分布c(M)。

SEDFIT使用部分比体积的估计值和大分子摩擦扩散比拟合c(s)或c(M)分布的系数，基于Lamm方程的近似解描述，平衡数据的分析通过使用SEDPHAT分析软件进行物种分析拟合。

纯化的LBD被用于评估GluN1和GluN2A的配体结合，包括Gly和l-glu，[3H]-甘氨酸和[3H]-l-glu用于测定配体结合，快速平衡透析（红色法）使用具有8kDa截止值的分子设备来平衡纯化的LBD和放射性标记的配体。

一系列放射性配体浓度从0.5-75μM用于测定，除了放射性配体外，每个反应混合物含有纯化的LBD浓度为4-6μM，蛋白质在50mMTris/50mM氯化钠缓冲液中，pH7.8，反应混合物在冰上孵育30-60分钟，然后转移到装有样品的红色设备腔室。

样品（100μL）和相应体积为300μL的缓冲液分别加入样品腔室和缓冲液腔室，样品在室温下轻轻摇晃6-7小时进行平衡，通过添加未标记的1000倍过量对照反应来排除非特异性结合，每个浓度点使用每组中的配体。

平衡后，从样品和缓冲液中取等体积的样品计数于LS6500计数器的腔室中，缓冲液腔室的计数对应于游离（[F]）配体浓度，而样品腔室的计数对应于结合配体浓度。

绘制结合配体浓度与初始浓度的图谱。通过非线性拟合将数据回归到GraphPadPrism软件中以获得亲和常数，KD从以下等式：

在胚胎中，通过使用1mg/mL的木瓜蛋白酶，葡聚糖N2B–/–小鼠的皮质神经元离解，将这些神经元接种在涂有聚-l-Lys的35mm培养皿上。

细胞培养基使用神经基础培养基，添加2%的B27补充剂（Invitrogen）和1%的l-glu以维持细胞培养，细胞培养在37°C的湿润气氛中进行，并含有5%的CO2。

全细胞膜片钳电生理学是在体外（DIV）13-20的GluN2B敲除（GluN2B-/-）小鼠的活体神经元上进行的，实验在室温下进行，记录时，神经元被浸泡在细胞外溶液中，该溶液由以下成分组成：140mM氯化钠、3毫米氯化钾、2毫米氯化钙、2毫米HEPES、1微米河豚毒素（河豚毒素）和20毫米葡萄糖，pH值为7.35。

使用阻抗为2-4MΩ的硼硅酸盐玻璃记录电极，并用火焰/棕色微量移液器拉拔器进行制备，记录电极用细胞内溶液回填，该溶液由以下成分组成：140毫米铯氟、2毫米氯化钙、2毫米乙基乙二醇、10毫米乙基丙二醇、2毫米四乙基铵氯化物、4毫米钠2ATP，pH值为7.35。

测试溶液使用快速溶液更换装置RSC-200进行交换，用含有100μMl-glu/10μMGly或d-ser/1μMTTX/0.5μM士的宁的细胞外溶液来诱发NMDA感应电流，记录使用Axopatch-200B放大器进行，通过内置滤波器进行低通滤波，并以1kHz的采样频率由Digidata1322A数字化仪（分子器件）进行数字化。

电压被钳位在-70mV，pH值为7.35，数据采集使用pCLAMP-8软件（分子器件），用夹紧配合和棱镜分析数据，并绘制图表。

峰值电流幅度和面积积分峰值电流进行了量化，通过配对t检验分析，进行了预孵育组和对照组之间差异的统计显著性测试。

已知许多iGluR亚型的LBD能够自我关联，尽管NMDAR的LBD的自我关联尚未明确，为了研究NMDAR亚单位的平衡情况，进行了沉降速度和沉降平衡实验，纯化了GluN1和GluN2A的重组LBD。

在沉降平衡数据拟合中，理论上单体的质量为GluN36为5.1kDa，GluN34A和同源二聚体的摩尔质量为9.2kDa，所使用的质量是相应单体摩尔质量的两倍，我们的结果表明，GluN1或GluN2A的LBD可以自我结合形成同源体。

GluN1和GluN2A的LBD都显示了二聚体形式，除了单体形式之外，添加l-glu导致了GluN2A的单体部分的显著增加，就像在GluN1中添加Gly一样，在任何情况下，添加激动剂都会导致每个LBD的二聚体形式解离为单体形式。

这表明激动剂结合会破坏两种GluN1的同型单体和GluN2A的同源二聚体，关于NMDAR的LBD自我关联，结果显示，这些结构域在没有配体的情况下会自我关联，这一发现具有重要意义，因为大多数已有的结构数据都是利用配体结合形式的受体，可能无法揭示同源体相互作用的性质。

为了研究激动剂对GluN1LBD异聚化和GluN2的影响，我们进行了沉降速度和沉降平衡分析，评估了同时存在或不存在l-glu和Gly/d-ser的GluN1和GluN2A的混合物。

展示了来自沉降速度分析的结果，单体和相应二聚体的平均分子量为36kDa和1kDa，使用拟合GluN2/GluNA异二聚体摩尔质量以实现沉降平衡分析，我们发现，只有当两种激动剂都存在时，二聚体的比例显著增加。

类似的结果也在用d-ser替换Gly时得到，沉降平衡分析得出了相同的结论，这些数据表明，两种激动剂与它们各自的LBD结合是异聚化所必需的驱动因素，NMDAR的双激动剂要求可能是一种启动机制，并在激活过程中维持NMDAR的异构状态。

我们还证明了通过5，7-二氯犬尿酸（DCKA），一种选择性甘氨酸结合位点NMDAR抑制剂，可以阻止激动剂驱动的异聚化，这一发现揭示了DCKA抑制机制干扰了NMDARLBD区域中GluN1-GluN2的相互作用，这也表明NMDAR亚单位的异聚化是其特征之一，可能成为药物研发的目标。

为了确定功能效应是否与GluN1和GluN2A的LBD之间的相互作用有关，进行平衡结合实验，使用放射性标记的Gly和l-glu与纯化的GluN1和GluN2A在微透析设备中进行配制。

我们分别测量了GluN1和GluN2A的LBD与Gly和l-glu两种蛋白质的结合解离常数（KD），实验结果表明，虽然GluN1的存在不影响l-glu对GluN2A的亲和力，但添加Gly显著增强了l-glu对GluN2A的结合亲和力，降低了KD值，同时B.max也更高。

max的增加表明结合平衡发生了变化，向GluN2A的稳定配体结合状态倾斜，配体的解离速率变慢，这意味着Gly与GluN1结合进入了与GluN2A的调节相互作用，然而，在与GluN1A结合的l-glu存在下，我们没有观察到类似的Gly与GluN2的结合增强。

这些结果明确表明，观察到的l-glu与GluN2A亚单位在完整异构体受体中的协同增强主要由LBD之间的相互作用驱动，而Gly的结合增强则不是通过LBD实现的，这一发现也突出了一个事实，即除了NMDAR的通道激活外，促激动剂对于功能调节是必需的。

通道激活引发了激动剂驱动的重排事件，假设可以直接在通道电流上观察到这一变化，我们进行了l-glu诱导的全细胞电流的测量，使用Gly或d-ser作为激动剂，在培养的GluN2B缺失小鼠皮质神经元中进行，并评估它们在完全刺激之前预孵育的影响，以观察通道在单个激动剂和两种激动剂存在时的开启情况。

我们发现，在所有三种情况下，总电导率显著增加，Gly或d-ser预孵育后，电导率增强主要表现为峰值振幅的显著上升，而l-glu预孵育后，电流增加主要是由于脱敏速度减慢，这些结果与我们的平衡结合和沉降速度实验数据一致。

表明将其中一种激动剂与其相应的LBD亚基结合可以破坏同源体之间的相互作用，这会改变四聚体中亚基的排列方式（对角线放置的1-2-1-2），激动剂的预孵育实现了第一步，这样当第二个激动剂结合时，通道的开启事件更快，峰值电流也高于同时使用两种激动剂时的峰值电流。

研究表明，N-甲基-d-天冬氨酸受体（NMDAR）结合域的异构化是一个复杂而关键的过程，其中助激动剂谷氨酸和甘氨酸通过对NMDAR的LBD进行平衡结合，控制沉降速度，助激动剂与其各自的LBD结合亚基会破坏同源体间的相互作用，并促进通道的开启。

【1】保莱蒂，《NMDA受体亚基多样性：对受体特性、突触可塑性的影响和疾病》

【2】赖同文，《谷氨酸受体离子通道：结构、调节和功能》

【3】艾哈迈德，《D-丝氨酸是一种内源性N-甲基-D-天冬氨酸受体甘氨酸位点的配体》

【4】沃尔穆斯，《NMDA受体结构揭示了亚基排列和孔结构》

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