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儿童支原体怎么检查的,支原体的检测方法有哪些?

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如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测?支原体的检测方法有哪些?目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR法、扫描电子显微镜法,这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况,选择不同的方法,或几种方法联合使用。

培养法为最为经济可靠的方法,但其实验周期较长,所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。

1.精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂,蒸馏水配制,高压除菌(加20%胎牛血清)。2.支原体琼脂培养基按说明称量粉剂,蒸馏水配制,高压除菌(加20%胎牛血清)。3.其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37°C培养箱。

1.样品的储存。样品取材后,最好尽快进行检测。样品如在24h以内进行支原体检测,可储存在2~8℃;如果超过24h样品应放置于-20℃以下保存。-20℃保存的样品,进行检测时需重新加入到对照培养细胞中,培养72h后,取上清直接进行接种检测。2.准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基(半流体)。3.将样品分别接种到10ml精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中(已冷却至36℃),每支培养基接种样品0.5~1.0ml.每种样品接种6支精氨酸肉汤培养基,3支半流体培养基。4.接种6d后,取3支精氨酸肉汤培养基中样品0.5~1.0ml.复种于精氨酸肉汤培养基中。5.36℃培养29d,每隔3d观察一次。记录实验结果。

培养结束时,精氨酸肉汤培养基如有支原体生长,则液体颜色改变(粉色或黄色)。半流体培养基中如有支原体生长,则出现絮状沉淀

荧光指示细胞法较为快捷,方法简单,但其灵敏度有一定的欠缺,易造成漏检。

常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱,其激发波长为350nm(紫外激发),发射波长为420nm。该染料会结合到DNA中富含A-T的区域,由于支原体的DNA中A-T含量占多数(55%~80%),所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体DNA,证明该细胞有支原体污染。

1.荧光显微镜。2.CO2培养箱。3.无菌小爬片。4.无菌培养皿。5.不含抗生素的完全培养液。6.二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml)。称取5mg二苯甲酰胺荧光染料加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中,在室溫下用磁力搅拌30~40min,使完全溶解,-20℃避光保存。7.二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml)。取1ml上述浓缩液,加至100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液中,终浓度为0.5μg/ml。8.固定液,即乙酸:甲醇(1:3)溶液为细胞固定液。9.封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml,0.2mol/LNa2HPO4·12H2O27.8ml,丙三醇50.0ml,以上三者混匀,调pH至5.5。10.不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO细胞。

(二)操作步骤1.无菌收集待测细胞上清:悬浮细胞离心后取上清液。2.VERO细胞爬片:将小爬片无菌置于小培养皿内,滴加VERO细胞悬液(细胞浓度约3×104个/ml)2~3ml,置于CO2培养箱内培养24h使其贴壁。3.制备标本。向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对照组(已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液),培养48h后(VERO细胞汇合前)将细胞爬片从平皿中取出。4.漂洗—将细胞爬片置于培养皿中,用不含酚红、NaHCO3的Hanks溶液(或PBS)漂洗3次。5.固定—用乙酸:甲醇(1:3)固定液固定10min。6.漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。7.染色—置于Hoechst33258工作液(0.5μg/ml)中染色10min。8.漂洗—去离子水中漂洗3次,每次1~2min。9.封片,紫外激发,观察。

(三)结果判断当阴性及阳性对照结果均成立时,结果有效。1.阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。2.阳性结果荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

(四)小结1.严格配制工作液及封片液。2.保证作为指示细胞的VERO细胞没有被支原体污染。3.必须同时设立阳性及阴性对照,注意重复,以排除假阳性和假阴性结果。4.应全面观察爬片,并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。5.可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间,避免出现非特异性染色,如胞浆着色。

PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少,既可做细胞本身,也可做细胞上清的检测,同时可以检测多种支原体的污染,是目前常用的检测手段。但其成本较高,条件要求严格,且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑的样品要经过3次PCR检测,或用培养法检测。

PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增实验,其基本原理是酶促DNA合成反应,即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA聚合酶的作用,使DNA链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点,但其对实验环境要求严格,实验成本较高,有时还会出现假阳性的现象。

PCR检测试剂盒、dNTP、TaqDNA聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。

1.样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d,用无菌容器取上清液500μl,4℃保存待测。2.模板的制作。在无菌的条件下,取细胞培养上清100μl于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子,95℃水浴加热5min。3.打开盖子,向管内加StrataCleanResin10μl,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5~10s,吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕,4℃保存。4.PCR反应。反应体系的最适条件为10mmol/LTris-HCI(pH8.38),50mmol/LKCI,1.5~2.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,2UTaqDNA聚合酶,总反应体系为50μl,反应用去离子水均需用紫外灯照射。(1)在0.5ml塑料离心管中加入35.2μl去离子水及5μl10xTaq反应缓冲溶液。(2)依次加入下列成分:0.4μldNTP(25mmol/L)、0.4μlTaq酶(5U/μl)、2μl引物。(3)加2μl去离子水,总体积45μl。(4)加5μl已制成的模板到反应体系中。(5)阳性对照,内对照各5μl加入到各自的反应体系中。(6)取1支含有以上反应体系的离心管,加入5μl去离子水作为阴性对照管。(7)在反应体系中加入100μl矿物油。(8)PCR程序见下表。

5.琼脂糖凝胶电泳。PCR反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。6.结果分析。该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上,Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带,当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和内对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条,可能是该样品感染2种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现,则可怀疑有支原体污染,重做该样品。

(三)注意事项PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性,有时需多次重复。

扫描电子显微镜法:扫描电子显微镜法非常直观、准确,对使用环境要求高,操作复杂,实验周期较长,常作为样品的最后定性检测。

利用电子显微镜的超级放大功能,直接观察培养细胞中支原体污染情况。

待检测细胞,0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA、2.5%的戊二酸、1%锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4),扫描电镜及相关设备。

1.将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。2.37°C,CO2培养箱中培养24h,取出盖玻片。3.以PBS洗涤3次。4.以2.5%戊二醛/PBS固定15min,PBS洗涤。5.以1%锇酸固定30min,PBS洗涤。6.乙酸异戊酯脱水。7.CO2冰点干燥。8.喷金。9.扫描电镜观察,照相。

支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

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