呼吸系统包括 如何对儿童进行这方面的诊断

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病原学检测技术在儿童呼吸系统感染性疾病中的合理应用

呼吸系统感染性疾病是儿童最常见的感染性疾病，肺炎是5岁以下儿童病死的首位原因，严重威胁儿童生命健康。

呼吸系统感染的病原种类繁多，且不同病原感染临床表现有相似之处，给临床诊疗带来了极大挑战。

对严重的下呼吸道感染患者，临床医生早期通常会在病原未明的情况下经验性使用广谱抗菌药物治疗。

广泛的经验性使用抗生素不仅增加了相关不良作用和医疗费用，更会增加细菌耐药风险。

病原体的快速鉴定是儿童呼吸系统感染性疾病早期诊断和合理用药的基础，对指导临床诊疗十分重要。

为规范儿童呼吸系统感染病原体检测技术的临床应用，提升病原体的诊断水平，本文对病原体检测常用检测技术在呼吸系统感染性疾病中的应用进行论述，以指导儿童呼吸系统感染病原体检测技术的合理应用，提升儿童呼吸系统感染的病原诊断能力。

病毒抗原检测适于早期筛查，多重聚合酶链式反应检测助力呼吸道病毒的快速和精准诊断

口咽拭子和鼻咽拭子的胶体金法病毒抗原检测是病毒检测较为常用的手段，方法简便，无检测环境和人员的要求，约30min即可出结果，且检测成本较低，特异度较高，推荐应用于门急诊呼吸道病毒感染的早期筛查，对临床决策指导合理用药意义较大。

但由于取材来源和样本病毒量不稳定及检测技术本身的问题，敏感性低。

病毒核酸检测可在较短时间内获得检测结果，敏感度和特异度较高，并可鉴定病毒亚型及检测病毒相对载量。

病毒核酸检测可用于不同呼吸道样本，包括鼻咽、口咽分泌物、痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液和活检肺组织等。

实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是最常用的方法。

多重PCR是在普通PCR技术上发展起来的，可同时检测多种病原体，对样本量的要求较低，检测时间短，可实现高通量、高灵敏度、高特异性检测，临床应用价值较高。

一项涉及5510个样本的荟萃分析显示多重PCR检测病毒灵敏度和特异性分别为94.0%和98.7%，与传统检测（例如快速抗原检测和病毒培养）相比，多重分子检测的准确性更高。

然而，它的多引物设计会导致假阳性率增加，其对残留污染检出率较高也对实验室封闭反应系统提出了更高的要求，尚不适用于实验室条件相对不足的基层医院。

多重PCR检测技术是目前临床最常用的可靠方法，可用于门急诊和住院患儿的早期快速病毒诊断，在高度怀疑病毒感染、病毒抗原快速检测阴性时也有重要作用。

机体感染病毒后首先出现特异性免疫球蛋白M(immunoglobulinM，IgM）升高，特异性IgM抗体检测可用于门诊、急诊或基层医院的病原体筛查。

但机体产生IgM在感染后1周左右，早期阳性率低。

另外，感染后IgM可持续3～6个月甚至更久，检测阳性需结合临床做出判断[7]。

血清IgG抗体检测需采集急性期及恢复期双份血清进行比较，且体液免疫缺陷的患者可呈假阴性，因此早期诊断价值有限。

病毒分离培养是诊断的金标准，特异度高，可进行病毒鉴定分型，但其实验要求高，操作复杂，检测时间较长，且敏感度差，不适合临床常规开展。

病原培养是协助临床诊断细菌感染最常用、最可靠的手段

呼吸道标本培养协助诊断细菌感染仍是临床应用的主流方法，可取下呼吸道分泌物、胸腔穿刺液、肺活检组织等标本进行病原培养和分离，并对培养的细菌进一步进行药敏试验，从而指导临床治疗。

对于社区获得性肺炎，早期痰液培养是目前临床最常用的方法。

肺泡灌洗液培养是明确细菌性肺炎的重要依据，因有创性检查，推荐用于经验抗生素治疗无效的肺炎、重症肺炎、免疫功能低下等患儿。

但细菌培养周期较长，且抗生素应用会使培养的敏感性降低，常需联合其他检测方法来明确诊断。

涂片染色镜检亦是发现细菌感染的重要方法，它的优点是快速、直观、成本低，临床易于开展，推荐呼吸道标本培养前常规进行涂片染色镜检，对于早期发现感染病原菌有一定的指导意义。

某些细菌感染还可进行快速抗原检测。

如尿肺炎链球菌抗原在发病1d内即可被检测到，且儿童尿标本简单易获取，对于呼吸道感染的儿童可通过测定尿抗原来实现肺炎链球菌的快速、早期诊断。

铜绿假单胞菌是下呼吸道感染常见致病菌，特别是医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎以及支气管扩张、肺囊性纤维化等患者，多重耐药铜绿假单胞菌导致的下呼吸道感染与更高的病死率有关。

以实时荧光定量PCR为基础的检测方法可直接检测耐药基因，也可通过检测不同药物浓度下目的基因扩增推断该抗菌药物浓度是否有效，还可通过逆转录PCR检测不同药物浓度下目的基因转录水平评估细菌的耐药性。

qPCR检测速度快，但耐药表型可能涉及多种基因突变及表达，仅检测单一耐药基因可能无法准确预测耐药表型。

上呼吸道样本的PCR检测对百日咳感染的诊断有重要意义，具有快速、准确、敏感度高（>90%）、特异性强（>95%）等特点，特别适合婴幼儿及未接受免疫接种的儿童及咳嗽<2周的患者。

咽拭子细菌培养是百日咳的标准检查方法，特异度100%，但培养周期长且敏感性低，特别是对经过抗生素治疗或标本采集时间过晚的患儿，可作为分子检测方法的补充，可用于分子检测阳性及没有条件开展分子检测的实验室。

实时聚合酶链式反应是目前诊断肺炎支原体感染的首选方法

肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae，MP）培养是诊断MP感染的金标准，特异度高，且可通过体外药敏试验判断是否为耐药菌，但需特定培养基，且程序复杂、耗时长，灵敏度较低，不能满足临床快速诊断的需求。

MP血清学酶联免疫吸附试验是应用较广泛的检测肺炎支原体感染的方法，但MP-IgM在感染后约1周检测到，无法早期诊断，在一定程度上会影响重症和/或难治性病例的早期干预。

胶体金免疫层析试纸条检测法可定性检测MP-IgM，试验结果可在5～10min内通过肉眼进行观察，该检测方法无需任何仪器设备，具有方便、快速、廉价等优点，但报告结果只显示阴性或阳性，不能报告滴度，适宜在一般基层医院和门急诊快速筛查开展应用。

颗粒凝集法通过检测恢复期和急性期MP抗体滴度呈4倍及以上增高或减低时可以确诊肺炎支原体感染，难以用于急性感染的早期诊断。

MP抗原检测特异度和灵敏度均较高，且无需专业仪器设备，操作简单快速，在早期和快速检测中具有潜在临床价值，但其具有高特异度和高假阴性的特点，更适用肺炎支原体感染的初筛。

MP分子检测技术主要为核酸扩增技术，包括DNA扩增和RNA扩增，具有周转时间快、污染可能性低、灵敏度高、特异度高、不受时间和免疫功能限制等优点，已被认为是诊断MP感染的金标准。

通过PCR法还可直接检测呼吸道标本耐药基因突变，获得结果快，在临床得到广泛应用。

基因点突变导致的靶点改变是MP对大环内酯类耐药的最重要原因，23SrRNA对结构域Ⅱ区和V区与抗生素直接结合的碱基点突变可导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药，可通过测定23SrRNA的2063、2064等位点突变判断耐药与否。

但所检测的耐药状况与临床疗效并不完全一致，临床结局可能还与大环内酯类药物的免疫调节作用以及病程自限等因素有关。

检验新技术助力结核病的快速诊断

结核分枝杆菌最常用的检测方法是涂片法，痰涂片是一种快速低廉、操作简便、被临床广泛应用的方法，但该方法无法区分死菌和活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低。

结核菌培养阳性是诊断结核诊断的金标准，与痰涂片相比，培养法虽然灵敏度增加不少，但检测周期太长，不但贻误治疗，也增加了传播时间。

结核分枝杆菌抗原阳性可作为结核感染的直接证据，且不受结核病患者免疫状态的影响。

由于单克隆抗体制备技术的发展，目前已可制备高效价的特异性抗体，使检测血清中的结核杆菌抗原成为结核诊断的新方法。

结核菌素试验是检测机体对结核杆菌免疫反应的经典方法，具有操作简便、价格便宜的优点，但试验结果受卡介苗接种及人体免疫状态的影响，在严重播散性结核病和免疫抑制儿童患儿中常出现假阴性。

γ-干扰素释放试验是通过检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素来判断是否存在结核分枝杆菌感染；特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌的干扰，且使用外周血标本进行检测不接触活菌，减少了人员感染的风险。

但γ-干扰素释放试验不能很好区分是活动性结核与陈旧性结核。

实时荧光PCR法检测结核杆菌核酸，可提升结核杆菌的检出率，准确率和敏感度均较高，结果与分离培养法检测结果有较高的一致性。

以RNA为检测靶标的检测技术方法使用16SrRNA为靶标，其灵敏度和特异度很高，是目前市场上唯一可以区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的分子生物学检测方法。

GeneXpert是一种全自动化分子诊断系统，是以结核分枝杆菌的RNA聚合酶活性位点编码区为靶标，采用半巢式实时半定量PCR进行病原体检测的方法。

对于临床疑似肺结核患儿、耐多药肺结核患儿，GeneXpert可先于抗酸染色或细菌培养作为初筛方法。

目前，GeneXpert技术用于检测结核分枝杆菌主要为结核分枝杆菌复合群快速分子鉴定及利福平耐药性检测（GeneXpertMTB/RIF)，GeneXpertMTB/RIF是通过检测结核分枝杆菌基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现结核分枝杆菌核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。

它具有以下优势：特异性好，能准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌；灵敏度高，检测快速，仅需要2h就完成检查了，适用于各种标本，如痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高。

GeneXpertMTB/RIF还可以应用于肺外结核及儿童结核的诊断，但不足的是该系统的设备和试剂盒成本均较高，故短期内是无法实现其在基层结核病实验室及医疗机构进行普及使用。

多种检测技术联合应用协助真菌的诊断

可引起肺部真菌感染的病原体种类较多，比较常见的包括隐球菌属、曲霉属、毛霉属、肺孢子菌属等。

显微镜检法检测真菌操作简便、快速，不需要特殊仪器设备，适合在各级实验室开展，但灵敏度相对较低，病原菌数量少时难以发现，且需要临床人员有一定的临床检验工作经验。

分离培养是诊断真菌感染的金标准，但部分真菌培养困难，如毛霉目，有时显微镜检可见大量菌丝，但培养阳性率不高，特别是呼吸道标本处理不当常导致毛霉目真菌菌体被损坏，生长困难。

另外，曲霉属与毛霉目真菌在周围环境中可见，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植。

因此，对培养阳性者应结合临床以区分真菌感染、环境污染及呼吸道定植。

肺部真菌感染常用的免疫学诊断试验包括1，3-β-D葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖抗原试验、曲霉免疫球蛋白G抗体试验、隐球菌荚膜多糖抗原试验等。

G试验可检测隐球菌和接合菌以外的真菌，阴性结果意义较大，可排除判断未发生隐球菌和接合菌以外的真菌感染；但受饮食、药物如白蛋白、抗菌药物等影响较大，易出现假阳性，需根据临床情况进行判定。

半乳甘露聚糖抗原试验主要用于辅助诊断侵袭性肺曲霉病，在中性粒细胞缺乏患者中易出现假阴性。

隐球菌荚膜多糖抗原试验在诊断隐球菌感染中具有极重要的价值，对于肺隐球菌病，支气管肺泡灌洗液的隐球菌抗原检测有高度的特异度和敏感度。

曲霉免疫球蛋白G抗体试验在超敏反应性支气管肺曲霉病与慢性肺曲霉病诊断中有较好的应用价值。

目前最常见的检测真菌感染的分子生物学方法是PCR，但其在真菌检测中的应用相对较少，主要原因在于真菌的细胞壁较厚，常规方法下核酸提取困难。

近年来，宏基因组二代测序的出现及临床应用为肺部真菌感染的诊断提供了非常重要的手段，使临床诊断下呼吸道真菌感染的方法更加丰富，具有重要的临床价值。

宏基因组二代测序是儿童疑难、重症呼吸系统感染性疾病病原诊断的重要补充

宏基因组二代测序（metagenomicnextgenerationsequencing，mNGS）技术是近年来兴起的非序列依赖的新型核酸检测方法，由于其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。

mNGS无需事先对样本进行特异性扩增，且能够无偏倚地在同一样本中同时检测已知或者未知的细菌、真菌、寄生虫和病毒，还能明确微生物的抗生素耐药情况。

在未知病原菌的感染性疾病暴发调查、传统检测结果阴性的感染患者、免疫缺陷患者及危重症感染患者的应用中均已证明了mNGS的独特优势。

可检测的标本包括血液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液等。

与传统检测技术比较，mNGS对标本选择不具有偏向性，且灵敏度特异度高、通量高，可有效发现新发病原，实现精准诊断。

对于儿童呼吸道感染，在病因不明且病情危重需要尽快明确病原体、疑似新发或特殊病原体感染、传统微生物检测技术多次阴性且治疗效果不佳等情况下，可以在常规病原检测的同时或在其基础上对样本进行mNGS分析，以高效获取感染病原体的信息。

在检出细菌及真菌方面，肺泡灌洗液标本具有更高的敏感性，而在检测病毒方面，外周血标本检出率更高，腺病毒肺泡灌洗液和血mNGS同时可以检出。

但由于mNGS操作程序复杂，对环境和人员要求较高，难以在基层实验室开展，且检测成本高，不推荐作为常规检测项目，主要用于重症感染、难以治愈的慢性感染、复杂/混合感染和免疫缺陷患儿感染的诊断[30]。

另外，mNGS检测过程混杂因素较多，不同的方法、平台、质控都可能影响结果，标准流程有待统一。

综上所述，传统呼吸道病原体检测手段如培养、涂片因敏感性和时效性差，不利于呼吸系统感染性疾病早期临床诊断和治疗。

呼吸道感染病原体抗原或抗体检测的多联检测时效性高，可用于早识别感染，并指导抗感染药物的合理使用。

快速分子检测的发展在很大程度上有助于加快呼吸系统感染性疾病的诊断，是对传统培养方法的有效补充，但不能完全替代传统培养方法。

mNGS检测对呼吸道病原体的早期发现，特别是疑难、急危重症及混合感染诊断等方面具有明显的优势。

在临床应用上，可以将传统的涂片、培养、抗原、抗体等检测方法与分子检测方法相结合，发挥优势互补，从而快速、准确识别呼吸道病原体、指导临床治疗。

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