抗心磷脂抗体igm 抗磷脂抗体检测的临床应用专家共识

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中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会；国家风湿病数据中心；国家免疫疾病临床医学研究中心。抗磷脂抗体检测的临床应用专家共识。中华内科杂志2019年7月第58卷第7期：496-500.

抗磷脂抗体（aPLs）是一组以磷脂和/或磷脂结合蛋白为靶抗原的自身抗体总称。aPLs主要存在于抗磷脂综合征（APS）等自身免疫病患者中，是APS最具特征的实验室指标。aPLs亦是血栓形成和病理妊娠的危险因素。同时，aPLs可见于恶性肿瘤、感染性疾病、某些药物使用后，甚至部分健康人群中亦可出现[1]。其中狼疮抗凝物（LA）、抗心磷脂抗体（aCL）、抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPⅠ）抗体作为APS分类标准中的实验室指标[2]，目前临床上广泛应用，亦成为临床实验室最为常见的自身抗体检测项目之一。aPLs检测的标准化对其临床应用至关重要，关于LA、aCL、抗β2GPⅠ抗体检测的临床应用标准化，已有不同国际学术组织发表的相关共识、指南[3-9]。

尽管已发表的国际共识、指南对规范aPLs的检测及明确其临床应用具有重要意义，但目前尚缺乏适合我国国情的aPLs检测相关临床应用共识，供临床及实验室遵循。中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会于2017年9月组织国内临床和实验室专家召开关于相关自身抗体检测临床应用共识会,由8位临床和实验室专家依据国内外相关文献，并结合国内实际情况及aPLs检测应用临床经验，分别独立起草共识草案，随后对草案进行讨论汇总形成共识初稿，经召开专家讨论会由所有专家组成员逐条审议讨论，达成一致意见后形成本共识，本共识的制定，旨在提高我国临床医务工作者对aPLs检测的正确解读、检测等方面的认识水平，规范aPLs检测，为临床提供规范可靠的aPLs检测结果报告。

aPLs根据靶抗原的特性主要分为：（1）LA：一组能与负电荷磷脂和磷脂蛋白质复合物相结合的免疫球蛋白，主要基于LA在体外能延长磷脂依赖的不同途径的凝血试验时间来进行检测；（2）抗负电荷磷脂抗体：aCL抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗磷脂酸抗体、抗磷脂酰肌醇抗体等；（3）抗中性磷脂抗体：抗磷脂酰胆碱抗体等；（4）抗两性磷脂抗体：抗磷脂酰乙醇胺抗体等；（5）抗磷脂结合蛋白抗体：抗β2GPⅠ抗体、抗凝血酶原抗体、抗蛋白C抗体、抗蛋白S抗体、抗膜联蛋白A2抗体、抗膜联蛋白A5抗体等[10]。其中LA、aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgG、抗β2GPⅠ-IgM已作为国际血栓与止血学会(ISTH)2006年修订的APS分类标准中的实验室指标[2]。

但随着新的生物标志物不断被研究发现，极大拓展了对aPLs的认识。许多新的aPLs已被证实可存在于临床高度疑似的APS，但APS分类标准中LA、aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgG、抗β2GPⅠ-IgM阴性的患者，且这些新的aPLs可与患者血栓形成或病理妊娠等临床表现具有一定的相关性[11-13]。如在中国APS患者新的aPLs研究显示，抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体（aPS/PT）存在APS患者，特别是aCL和抗β2GPⅠ阴性的APS患者，与APS患者的血栓形成密切相关，亦与LA存在一定的相关性[14-15]。抗β2GPⅠ结构域Ⅰ-IgG阳性能增加APS患者的血栓形成风险，与抗β2GPⅠ-IgG显著相关[16]。因此，这些新的aPLs有望成为APS分类标准中的实验室指标。

二、aPLs检测的临床应用

1.APS筛查及诊断：aPLs作为APS特征性的生物学标志物，已成为APS分类标准中的实验室指标。根据国际血栓与止血学会(ISTH)2006年修订的APS分类标准，至少满足1条临床标准和一条实验室标准方可诊断APS，见表1。

表12006年国际血栓与止血学会修订的APS分类标准[2]

1.血栓形成：任何器官/组织发生的1次或1次以上动、静脉或者小血管血栓形成（浅表静脉血栓不作诊断指标）；必须有客观证据（如影像学、组织病理学等）；组织病理学如有血栓形成，必须是血栓部位的血管壁无血管炎表现。

（1）1次或多次无法解释的形态学正常的胎龄≥10周胎儿死亡，必须经超声检查或对胎儿直接体检表明胎儿形态学正常；

（2）在妊娠34周前，因重度子痫或重度先兆子痫或严重胎盘功能不全所致1次或多次形态正常的新生儿早产；

（3）连续3次或3次以上无法解释的胎龄﹤10周的自然流产，需除外母亲生殖系统解剖异常，或激素水平异常，或因母亲或父亲染色体异常等因素所致；

·实验室标准：

（1）狼疮抗凝物阳性：需按照国际血栓与止血学会的指南在血浆中测得狼疮抗凝物至少2次，每次间隔至少12周。

（2）采用标准化的ELISA法检测血清或血浆中抗心磷脂抗体（aCL）：IgG/IgM型中高滴度阳性（IgG型aCL大于40GPL；IgM型aCL大于40MPL；或滴度大于99的百分位数）。

（3）采用标准化的ELISA法检测血清或血浆抗β2糖蛋白Ⅰ抗体（抗β2GPⅠ）：IgG/IgM型阳性（滴度大于99的百分位数）。

注：上述检测均要求间隔12周以上，至少2次或2次以上阳性，如果aPLs结果阳性与临床表现之间间隔<12周，或间隔超过5年，则不能诊断。

随着对aPLs的认识不断深入，aPLs与多种分类标准外临床的表现有密切关联，包括血小板减少症、溶血性贫血、肾脏病变（如血栓性微血管病相关肾病、恶性高血压）、心脏瓣膜病变、皮肤病变（如网状青斑、皮肤溃疡）、神经系统病变（偏头痛、舞蹈症、癫痫、原因未明的认知功能障碍）等。

综上，临床上建议检测aPLs的群体不仅限于动脉或静脉血栓事件患者、病理妊娠患者，还应包括出现上述APS分类标准外的临床表现的患者。

LA、aCL及抗β2GPⅠ抗体的联合检测不仅用于APS的诊断，还有助于APS患者血栓事件再发风险分层。与aCL、抗β2GPⅠ抗体比，LA阳性与血栓、病理妊娠等临床事件有更强的相关性[[i]]。与aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgM比，aCL-IgG、抗β2GPⅠ-IgG阳性与发生的临床事件相关性更大。LA、aCL、抗β2GPⅠ抗体同时阳性（即3种抗体阳性），与1种或2种自身抗体阳性比，血栓形成或病理妊娠的发生几率更高。aCL、抗β2GPⅠ抗体的IgG、IgM亚型，阳性检测值高低与临床事件的相关性尚不明确。

血栓风险评估：国外已有研究提示，GAPSS（国际APS评分）评分系统[包括高血压1分，高脂血症3分，LA4分，aCL-IgG/IgM5分，抗β2GPⅠ-IgG/IgM4分，抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体（aPS/PT）3分]能有效预测SLE和APS患者血栓再发风险；GAPSS10分为血栓再发高危人群。

病理妊娠风险评估：LA、aCL、抗β2GPⅠ抗体同时阳性（即3种抗体阳性），既往明确病理妊娠史，以及合并SLE等其他结缔组织病是APS患者发生病理妊娠的高危因素。

LA的检测方法包括：（1）筛查试验：包括稀释的蝰蛇毒磷脂时间法（dRVVT）、活化部分凝血活酶时间法（APTT）、硅凝固时间法（SCT）、大斑蛇凝血时间法（TSVT）及蛇静脉酶时间法（ET）等[21]。目前，ISTH、临床实验室标准化协会（CLSI）等国际指南[3,22]推荐对LA采用2种不同凝血途径的方法进行检测，其中dRVVT和APTT是国际上最常用的检测方法，通常dRVVT作为第一种选择的方法，敏感性较好的APTT（低磷脂或二氧化硅作为活化剂）作为第二种方法。（2）混合试验：将患者血浆与正常血浆（1:1）进行混合，以证实凝血时间延长并不是由于凝血因子缺乏导致。（3）确证试验：采用改变磷脂的浓度或组成来确证LA的存在。LA的相关检测流程，见图1。但在临床实践中，会出现混合试验由于加入正常血浆后引起的稀释作用，从而导致本来弱阳性的LA出现假阴性检测结果，另外亦会由于其他原因引起混合试验的假阴性。因此CLSI[22]提出，对于LA的检测程序为筛查试验-确证试验-混合试验，当筛查试验和确证试验检测结果难以解释时再进行混合试验。同样第14届抗磷脂抗体国际会议上亦提出[13]，LA的检测程序为筛查试验-确证试验，当筛查试验或确证试验阴性时，如临床疑似APS时，需进行混合试验。

LA的检测应在抗凝药物治疗前或抗凝药物停用足够时间（至少1周）后采集血液标本。使用0.109mmol/L柠檬酸钠进行抗凝，抗凝剂与血液的比例为1：9。血液标本采集后应及时进行离心（推荐2次离心，），以确保离心后血浆中的血小板计数小于10x109/L，确保凝血因子活性。不建议采用过滤法分离获得血浆。若不能及时检测，离心后的血浆标本需-70℃或更低温度保存，检测前使用37℃水浴复溶血浆标本，并充分混匀。LA混合试验（循环抗凝指数）和确证试验（纠正百分比、标准化比值）的检测结果建议采用待测患者血浆与正常血浆的比值来表示，LA检测结果除上述比值以外，还应有阴性、阳性的结果判断。建议使用非参数的百分位数方法建立临界（cutoff）值，推荐采用99的百分位数（99%），大于临界值判断为阳性[3]。

注：该检测程序适用于未服用抗凝剂的患者；加入磷脂后凝固时间显著缩短，通常定义为加入磷脂前的凝固时间/加入磷脂后的凝固时间的比值大于1.3[1]；dRVVT：稀释的蝰蛇毒磷脂时间法；APTT：活化部分凝血活酶时间法

（二）aCL抗体、抗β2GPⅠ抗体[4]

1.标本要求：建议使用血清标本，避免热灭活、溶血及脂血标本。血清标本2~8℃可保存2~3d，-20℃及以下温度能更长时间保存，避免反复冻融。

2.aCL抗体、抗β2GPⅠ抗体的不同亚型：建议检测aCL-IgG和aCL-IgM抗体、抗β2GPⅠ-IgG和抗β2GPⅠ-IgM抗体，若aCL、抗β2GPⅠ抗体的IgG和IgM亚型阴性，但临床疑似APS时，建议检测aCL、抗β2GPⅠ抗体的IgA亚型。

3.靶抗原：aCL抗体检测的靶抗原应包括心磷脂和β2GPⅠ，抗β2GPⅠ抗体检测的靶抗原应采用包括全部氨基酸序列区域（结构域Ⅰ~Ⅴ）的人源性β2GPⅠ。

4.检测方法：ELISA作为aCL、aβ2GPⅠ抗体的常规检测方法，目前在临床上广泛应用。但ELISA方法存在标准化的缺乏、实验操作的影响因素较多、实验室间检测结果的变异系数大等缺陷[23]。而化学发光法（CLIA）检测aCL、抗β2GPⅠ抗体与ELISA比，具有较高的敏感性和特异性，能实现实验操作简单、快速、自动化、急诊模式进样、定量检测及变异系数小等[24-26]。

另外，近年来美国病理家学会（CAP）关于aCL、抗β2GPⅠ抗体检测室间质评结果显示，其检测方法已从最初的仅使用ELISA发展到CLIA、荧光酶免疫法（FEIA）和悬浮微阵列技术（xMAP）等。因此，化学发光法、荧光酶免疫法、悬浮微阵列技术等自动化、定量检测方法是aCL、抗β2GPⅠ抗体今后发展的必然趋势，且会逐渐应用于国内的临床实验室。

4.检测结果单位：aCL-IgG、aCL-IgM检测单位建议使用GPL、MPL（即1个GPL、MPL单位分别为1ug/ml纯化的IgG、IgM型aCL结合抗原的活性）。抗β2GPⅠ抗体检测结果的国际单位正在进行有效性研究。使用国际单位可促进检测结果在不同实验室、方法学间的一致性和可比性。

5.定标：建议使用多点定标，定标值与其预计值的相关系数应大于或等于0.90。

6.精密度：建议免疫学方法检测aCL、抗β2GPⅠ抗体的变异系数（CV）应小于或等于10%，CV值20%是最大可接受值。精密度评估应包括检测范围的多个水平值（包括临界值）。对厂家提供的检测试剂，应在说明书中明确预期达到的精密度。

7.室内质控：每批次检测时，建议使用阴性和阳性质控物进行质控，推荐使用外部质控物，阳性质控至少要包括检测值接近临界（cutoff）值的质控物。若阴性或阳性质控物的检测结果超过既定的检测范围，如阴性质控检测为阳性，或阳性质控检测为阴性，则应拒绝该批次实验。

8.参考值：（1）定性检测：建议使用非参数的百分位数方法建立临界（cutoff）值，推荐采用99的百分位数（99%），大于临界（cutoff）值判断为阳性；（2）定量检测：可参照CLSIEP28-a3c的要求，募集至少120例表观健康人群的血浆标本建立参考区间，临床实验室可采用20~60例表观健康人群验证该参考区间。

9.检测结果报告：建议aCL、抗β2GPⅠ抗体的检测结果报告中应包括检测方法、检测结果及单位。aCL、抗β2GPⅠ抗体的中高滴度检测结果通常为99的百分位数（99%）的2倍以上。

四、aPLs检测结果的临床解读[1,13]

1.APLs阳性不仅是APS的诊断标准之一，aPLs阳性亦可出现在SLE等自身免疫病、恶性肿瘤（如淋巴瘤、白血病、肺癌等）、感染性疾病（如梅毒、结核、传染性单核细胞增多症等）、某些药物（如普鲁卡因酰胺、氯丙嗪、避孕药等）使用后及部分健康人群中。

2.接受华法林、肝素及新型口服抗凝剂治疗的患者可能出现LA假阳性，因此对接受抗凝剂治疗患者的LA检测结果，应谨慎解读。由于当前LA检测缺乏标准化，若检测结果与临床不符时，应进行实验室与临床的相互沟通，以明确其确切意义。

3.aCL、抗β2GPⅠ抗体检测通常包括IgG、IgM、IgA亚型。aCL-IgA、抗β2GPⅠ-IgA目前尚未纳入APS分类标准，单独aCL-IgA、抗β2GPⅠ-IgA中高滴度阳性临床上较少出现，确切的临床意义仍有待深入研究。

4.aPLs低滴度阳性可见于生理性、暂时性、感染或病理状态。尽管APS分类标准中要求APLs持续中高滴度阳性，但低滴度aPLs亦可能有临床意义（特别是病理妊娠），需密切结合临床表现加以判断，必要时重复检测。另外，由于不同aPLs检测方法学间的差异，检测结果数值不具可比性。因此，在目前aPLs检测时缺乏参考物质、参考方法等情况下，对aPLs低滴度阳性需结合患者临床表现，并定期检测随访。

5.新型aPLs检测项目：虽然LA、aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2GPⅠ-IgG、抗β2GPⅠ-IgM抗体检测是APS分类标准中的实验室指标，但其他新型APLs检测项目（如aPS/PT、aCL-IgA、抗β2GPⅠ-IgA、抗β2GPⅠ结构域Ⅰ抗体等）的相关临床意义，仍有待在长期、前瞻性的研究及临床实践中深入探讨。

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